Um dos pilares da Biotecnologia, a Engenharia Genética é o processo de manipulação direta do DNA para alterar características de interesse de um organismo. Com essa tecnologia, é possível trocar os pares de bases (A-T ou C-G) de um genoma, deletar toda uma região do DNA, introduzir uma cópia adicional de um gene de interesse ou até mesmo extrair o DNA de um organismo e combiná-lo ao genoma de outro. Para tal, essa ciência tão impressionante e linda depende de nossas habilidades em realizar alguns procedimentos essenciais. Separamos cinco deles, vamos conhecer?
1. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A Reação em Cadeia da Polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction, PCR) é uma técnica utilizada para amplificar regiões específicas de DNA, aumentando o número de cópias dessas regiões. A PCR tem diversas finalidades em laboratório, como a clonagem de fragmentos de genes para analisar doenças genéticas, identificação de DNA exógeno contaminante em uma amostra e amplificação de DNA para sequenciamento.
A PCR é uma técnica baseada na capacidade da enzima DNA polimerase de sintetizar uma nova fita de DNA complementar a uma fita molde. Dessa forma, uma pequena quantidade de fragmento de DNA pode ser clonada em milhares de cópias, facilitando a sua detecção.
2. Enzimas de Restrição
A descoberta de Enzimas de Restrição (ou Endonucleases de Restrição) teve papel essencial para a Engenharia Genética. Produzidas naturalmente por bactérias como um mecanismo de defesa contra DNA exógeno, estas enzimas cortam o DNA em locais específicos (os sítios de restrição), baseando-se na sua sequência de nucleotídeos. Bastante utilizado em tecnologia de DNA recombinante, esse processo cria uma extremidade conhecida como coesiva ou colante (“sticky end”) no DNA clivado, que permite que ele seja ligado a outro fragmento de DNA ou inserido em um vetor. O fragmento é então “colado” pela enzima DNA ligase, que cria uma ligação fosfodiéster necessária para completar o esqueleto do novo DNA transgênico.
Figura traduzida, clique na imagem para visualizar a original.
3. Eletroforese
A amplificação de DNA ou a sua clivagem utilizando enzimas de restrição não seriam técnicas tão úteis se não fosse possível visualizar o DNA. Muito utilizado em diversos propósitos na Biologia Molecular, desde visualizar o DNA cortado e identificar o seu tamanho até detectar insertos de DNA e knockouts, esse método permite separar e analisar macromoléculas (DNA, RNA e proteínas) e seus fragmentos baseando-se no tamanho e polaridade delas.
4. Transformação da Célula
O processo de transferência de material genético exógeno (como um plasmídeo) para dentro de uma célula hospedeira é chamado de transformação. Na natureza, isso acontece através do contato direto entre duas bactérias, processo conhecido por conjugação. Em Engenharia Genética, foram criadas técnicas similares in vitro, que requerem que as células hospedeiras sejam expostas a uma mudança ambiental que as tornam “competentes” ou temporariamente permeáveis ao vetor recombinante. Esses métodos de permeabilização podem ser físicos (eletroporação, biobalística e choque térmico) ou químicos (utilizando o cloreto de cálcio paralelamente com a técnica de choque térmico). A transformação celular é comumente utilizada para a preparação de DNA plasmidial em larga escala e para a seleção de clones recombinantes, sendo que a célula mais comumente utilizada é a célula bacteriana de Escherichia coli.
Dentre os principais métodos de transformação celular, o mais eficiente é a eletroporação. Nessa técnica, as células são preparadas com solução aquosa para se tornarem competentes e então são submetidas a alta voltagem (choque elétrico) que provoca uma desestabilização da membrana externa e a formação de poros,
possibilitando a entrada do DNA para o interior da célula.
5. Método para seleção dos organismos transformados
Como nem todas as células recebem o DNA exógeno durante o processo de transformação, é essencial que exista um método que identifique as células efetivamente transformadas. Geralmente, plasmídeos usados como vetores carregam genes de resistência a antibióticos e as células que os recebem podem ser selecionadas baseando-se na expressão desses genes e na sua habilidade de crescer em meios que contêm antibióticos. Outra maneira de seleção depende da presença de proteínas repórteres como, por exemplo, o sistema X-gal/lacZ na triagem azul-branca (blue-white screening).
Nessa técnica, é avaliada a funcionalidade da enzima β-galactosidase, que é capaz de quebrar o substrato X-gal em galactose e um pigmento azul insolúvel (4-chloro-3-brom-indigo). A deleção do gene lacZ (mutação lacZΔM15) gera uma enzima β-galactosidase não funcional. As células que foram transformadas com sucesso possuem então a β-galactosidase não funcional e, portanto, não conseguem degradar o substrato X-gal presente no meio, crescendo em colônias de cor branca. As células que crescem na cor azul, possuem a enzima β-galactosidase funcional, sendo capazes de degradar o X-gal, logo crescendo em colônias de cor azul.
Sistema azul-branco (Blue-white screening). Nessa técnica, as células de interesse (as que foram transformadas) crescem na cor branca pois são incapazes de degradar o substrato X-gal.
Por possuir papel fundamental na biotecnologia, o conhecimento dessas ferramentas é crucial, já que, sem elas, não seria possível o desenvolvimento de alguns medicamentos, alimentos engenheirados, dentre outras aplicações. Agora que você já sabe que engenheirar genes não é simplesmente “recortar e colar” DNA, que tal compartilhar essas informações com seus colegas para que eles também conheçam um pouco mais sobre essas maravilhas biotecnológicas?
Referências
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BROOKS, Geo. et al. Microbiologia Médica de Jawetz, Melnick e Adelberg. 25. ed. São Paulo: Artmed, 2012.
CASE, Christine; FUNKE, Berdell; TORTORA, Gerard.Microbiologia. 10. ed. Porto Alegre/rs: Artmed, 2012.
WIKIPEDIA. Genetic Engineering. Disponível em: <https://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_engineering> Acesso em: 05/11/2017.
Biology Discussion. Genetic Engineering: History, Molecular Tools, and Everything Else. Disponível em: <http://www.biologydiscussion.com/genetics/engineering/genetic-engineering-history-molecular-tools-and-everything-else/9833>. Acesso em: 01/11/2017.
