A observação de algumas estruturas biológicas não pode ser feita a olho nu, devido às limitações de resolução do olho humano. A invenção do microscópio foi revolucionária, uma vez que a microscopia possibilitou a observação e a exploração do mundo microscópico, até então desconhecido. De uma forma extremamente básica, o microscópio é composto por uma associação de lentes com alta resolução que ampliam a imagem de objetos pequenos. Neste texto vamos explicar as diferenças entre os diferentes tipos de microscópio ópticos, iniciando por uma breve história da microscopia.
Breve histórico dos microscópios
Como surgiu esse equipamento? A história é um pouco nebulosa, mas o consenso atual é que o microscópio tenha sido inventado por Hans Janssen e seu filho, Zacharias, holandeses que fabricavam óculos, por volta de 1590. Esse objeto bem primitivo era capaz de ampliar em cerca de 30x os objetos.
A primeira descoberta biológica utilizando um microscópio foi feita em 1665 pelo biólogo Robert Hooke. Utilizando lentes com a capacidade de ampliar as imagens em 270x, Hooke observou cortes de cortiça (material vegetal obtido da casca de sobreiros (Quercus suber) com o qual se produz rolhas) e verificou a presença de compartimentos microscópicos na cortiça, os quais denominou “célula”, derivado do latim cella, que significa câmara. Entretanto, o uso de um microscópio para observações científicas só se deu em 1674 com Antonie van Leeuwenhoek. O microscópio de van Leeuwenhoek possuía apenas uma lente de vidro que era capaz de ampliar cerca de 300x com nitidez razoável. Ele então passou a observar bactérias, glóbulos vermelhos e a existência de espermatozóides.
De 1674 até hoje os microscópios evoluíram bastante, e atualmente são classificados em microscópios ópticos (MO) e microscópios eletrônicos (ME). Aqui neste link você pode ler mais sobre a evolução dos microscópios!
Quais as principais diferenças entre os microscópios ópticos e os microscópios eletrônicos?
As principais diferenças entre as metodologias de funcionamento de ambos se encontram no limite de resolução (LR), tipo de feixe (feixe luz visível ou feixe de elétrons) para formar as imagens e nas lentes utilizadas. O LR é a distância mínima entre dois pontos em que podemos observá-los como pontos individualizados e é devido a essa variável que os microscópios permitem a observação de células, tecidos, microorganismos e organelas.
A olho nu, o LR é de 0,2 mm e dois pontos em uma distância inferior são vistos como um ponto único; para o microscópio óptico é de 0,2 µm e para o microscópio eletrônico é de 0,2 nm (ou seja 1.000.000 vezes menor que a LR do olho nu). É importante ressaltar que essa diferença do LR se deve ao comprimento de onda da luz ou de energia que forma a imagem, uma vez que o MO utiliza a luz visível e o ME utiliza um feixe de elétrons para formar as imagens. Em relação às lentes, o MO utiliza as de vidro enquanto que o ME utiliza lentes eletromagnéticas.
Devido à variedade de equipamentos existentes, esse texto vai abordar especificamente os microscópios ópticos. Os microscópios eletrônicos ficarão para nosso próximo texto!
Microscopia Óptica
A microscopia óptica também é conhecida por microscopia de luz. Isso se deve ao fato de que neste tipo de equipamento as imagens são formadas através da emissão de um feixe de luz na faixa visível. O MO é amplamente utilizado em diversas áreas, desde a microeletrônica até biotecnologia e biologia. Exemplo de suas aplicações nas ciências biológicas são a visualização de células vegetais, animais, fungos e bactérias e, também é utilizado para averiguar a viabilidade celular em cultivos de células e também identificar subestruturas, como as organelas.
Atualmente existem diversas variações na estrutura do microscópio, entretanto, os componentes básicos se resumem na figura abaixo. As lentes oculares são as que proporcionam a visualização da imagem, é onde “encaixamos” os olhos e elas possuem ajuste de foco para corrigir a diferença de visão entre os dois olhos. É bom ressaltar que, ao contrário do que muito é feito, as amostras analisadas devem ser observadas com ambos os olhos nas lentes oculares e não apenas um.
O revólver é o componente mecânico que contém as lentes objetivas, ele possui capacidade giratória para escolher diferentes aumentos entre as lentes. As lentes objetivas são as mais importantes do MO, pois são elas que fornecem o aumento da imagem da amostra. O tubo é o componente físico que conectam as lentes oculares às lentes objetivas. O braço é a parte que conecta o tubo à base do microscópio. A platina, também chamada de mesa, é uma plataforma plana na qual a lâmina com a amostra é colocada. A amostra depositada sobre a platina é mantida estável e presa através das pinças e o botão charriot (não representado na figura) é responsável por mover a platina para cima e para baixo, esquerda ou direita.
O condensador é o componente que concentra o feixe de luz da fonte de luz sobre a amostra e o diafragma (não representado na figura) é o botão que ajusta a quantidade de luz que irá atingir a amostra. Por final, os componentes essenciais do MO são o dispositivo macrométrico, que estabelece um foco geral para a amostra e o dispositivo micrométrico, que ajuda um foco bem mais preciso, aumentando o detalhamento da amostra. Esses dispositivos são ajustados de acordo com a visão de quem está avaliando e com a qualidade da imagem, se estiver sendo gerada para a gravação em câmera.
1 – Microscópio de Campo Claro
Funcionamento: a microscopia de campo claro é o tipo de funcionamento mais básico dos microscópios e é a mais comumente utilizada. Nesses microscópios, o feixe de luz passa através da amostra, iluminando a área onde a mesma se encontra. O feixe de luz é então captado pela objetiva e pode ser observado pelo pesquisador ou por uma câmera acoplada. Estruturas muito claras precisam de corantes.
Aplicação: visualização da morfologia de células, tecidos e microrganismos; muito utilizado para a disciplina de histologia e laboratórios de pesquisa em geral, além de exames de rotina em laboratórios de análises clínicas. Pode ser realizada com amostras vivas ou fixadas.
2 – Microscópio de Invertido
Funcionamento: como o próprio nome diz, o microscópio invertido possui sua estrutura inversa ao de campo claro. Nesses microscópios, o feixe de luz é localizado acima da amostra e as lentes objetivas abaixo. Além disso, ao invés de uma platina exclusiva para lâminas, o microscópio invertido possui iluminando a mesa em um tamanho grande, na qual é possível observar placas de petri e também placas de titulação. Com exceção dessas características, o seu funcionamento é similar ao microscópio de campo claro.
Aplicação: visualização de viabilidade e confluência de células em cultivo celular em placa; visualização de organóides; visualização de cultivo de bactérias. Muito utilizado em laboratórios de pesquisa em geral, principalmente para o cultivo de células, e também em análises clínicas.
3 – Microscópio de Campo Escuro
Funcionamento: a microscopia de campo escuro consiste em utilizar uma iluminação um pouco diferente. Nesse método, é usado a iluminação oblíqua com o objetivo de aumentar o contraste da amostra, sendo assim, a luz atinge a amostra em ângulos oblíquos e então é difratada, refratada e refletida (use esse link para entender sobre fenômenos ondulatórios) nas lentes objetivas, gerando uma imagem brilhante sob um fundo escuro. Nesse vídeo há uma boa explicação sobre microscópios de campo claro e campo escuro.
Aplicação: é bastante utilizado na prática clínica para verificar a existência de cristais na urina (exemplo: ácido úrico) e identificar a presença de Treponema pallidum, a bactéria causadora da sífilis. Além disso, é indicado para todo o tipo de amostra com pouco contraste.
4 – Microscópio de Contraste de Fases
Funcionamento: o microscópio de contraste de fases utiliza um sistema de lentes que transformam as diferenças de fases da luz em diferenças de intensidade luminosa, baseado no princípio da difração da luz. Dessa forma, a luz atravessa a amostra em quantidades diferentes, gerando diferentes índices de refração. As porções escuras da imagem correspondem a porções mais densas da amostra, e as mais claras, as porções menos densas.
Aplicação: é bastante utilizado nas pesquisas de diversas áreas quanto na prática clínica na observação de células e tecidos não corados, células vivas em cultura, microrganismos, hematologia, virologia, bacteriologia e entre outras análises.
5 -Microscópio de Contraste Interferencial
Funcionamento: a microscopia de contraste interferencial surgiu com modificações no microscópio de contraste de fase. Nesse sistema, o feixe de luz é minimamente cortado, produzindo imagens mais agradáveis ao observador que exibem gradientes de contraste. As amostras não precisam ser fixadas e nem coradas nessa técnica. Devido à sua melhor resolução, a imagem tem aparência 3D.
Aplicação: visualização de tecidos e células vivas, sem coloração.
6 -Microscópio de Polarização
Funcionamento: o microscópio de polarização utiliza um polarizador (filtro polarizante) localizado entre a fonte de luz e a amostra, e um segundo polarizador (analisador) localizado entre a objetiva e a ocular. O contraste da imagem surge com a interação entre a luz polarizada e a luz com refração dupla (birrefringente). Esse sistema revela informações bem detalhadas sobre a estrutura e a composição dos materiais, uma vez que melhora a qualidade da imagem.
Aplicação: inicialmente utilizada no estudo de minerais, mas bastante utilizado para o estudo das paredes celulares, DNA, células musculares, espermatozóides e colágenos.
7 -Microscópio de Fluorescência
Funcionamento: a microscopia de fluorescência utiliza a propriedade que certas moléculas possuem de emitir luz com comprimento de onda na faixa visível quando exposta a uma luz ultravioleta (UV). Moléculas que não possuem essa propriedade podem ser marcadas com corantes fluorescentes, ao que chamamos de fluorescência induzida.
Aplicação: técnica que apresenta bastante crescimento nas ciências biológicas e ciências médicas, muito utilizada para os ensaios imunocitoquímicos e imunohistoquímicos, visualização de junções intercelulares, fibras nervosas, visualização de proteínas e estruturas celulares específicas, marcadores de crescimento e de transgênese.
8 – Microscópio Confocal
Funcionamento: a microscopia confocal é similar à de fluorescência, porém a técnica confocal permite o aumento do contraste da imagem microscópica e a construção de imagens tridimensionais. Esse tipo de sistema permite a observação de tecidos em tempo real, além de fornecer alta resolução. Existem três tipos de microscópios confocais disponíveis no mercado:
- o Microscópio de Varredura a Laser Confocal (LSCM), que é o modelo mais utilizado, pois fornece imagens com alta resolução e qualidade e permite fazer a reconstrução tridimensional da topografia do que está sendo analisado;
- o Microscópio Confocal de Disco Giratório, que fornece uma reconstrução mais rápida que o LSCM, sendo útil em observações dinâmicas;
- O Microscópio de Matriz Programável (PAM), que possui controles eletrônicos e utiliza uma matriz de pixels que é capaz de ajustar os pixels gerados na imagem observada, como opacidade e refletividade.
Aplicação: vastamente utilizado na pesquisa biológica para a obtenção de informações computadorizadas, como na área de neuroanatomia e neurofisiologia. Com esse microscópio também é possível obter imagens de organóides e esferoides celulares, além de conseguir melhor resolução em imagens de células com fluorescência.
A área da microscopia é baseada em conceitos físicos, muitas das vezes, bem complexos. Porém, o entendimento das técnicas de microscopia biológica possui grande valor na formação de qualquer profissional das áreas das ciências biológicas e da saúde. É graças à microscopia que a ciência tem informações tão detalhadas do mundo micro, que permitiram o desenvolvimento de diversas tecnologias e aplicações baseadas nessas informações.
Cite este artigo:
LOURENÇO, D. A. Microscopia e biologia parte I: conhecendo os microscópios ópticos e suas aplicações.Revista Blog do profissão Biotec. V.8 março/2021.
Fonte imagem destaque: Imagem de Yassine Khafalli por Unsplash.
