A tecnologia das tesouras moleculares CRISPR ficou famosa em 2017 por permitir aos cientistas fazerem coisas incríveis com a capacidade da enzima de “recortar e colar” o DNA. Agora, os cientistas otimizaram ainda mais a tecnologia CRISPR e vão utilizá-la como biossensor para detectar infecções virais.
O sistema tradicional de CRISPR utiliza a proteína Cas9, derivada da bactéria Streptococcus pyogenes, como ferramenta para a edição do genoma. Mas existem outros tipos de sistema CRISPR, cada um com uma característica específica.
Dois sistemas foram reportados para a construção do bissensor que apareceu na página News and Views da Revista Nature agora no dia 30 de abril.
Sensores virais
Algumas infecções virais são difíceis de serem detectadas quando o número de partículas virais circulantes é muito baixo. Por exemplo, durante o surto do vírus da Zika, alguns animais infectados carregavam apenas uma cópia do vírus por microlitro de sangue (o que equivale a 0,001 vírus por mL).
A tecnologia CRISPR é muito sensível e específica, e poderá ser utilizada como ferramenta de diagnóstico para detecção de infecções com baixa carga viral.
Sistema DETECTR
Um dos sistemas foi chamado de DETECTR (DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter), e utiliza a proteína Cas12a para encontrar o DNA viral. A Cas12a tem uma atividade colateral de cortar fitas simples de DNA indiscriminadamente após encontrar seu alvo de fita dupla (o DNA viral, no caso). Os pesquisadores se aproveitaram dessa atividade para criar o biossensor de detecção viral.
- Como o sistema funciona?
Além do sistema CRISPR com a enzima Cas12a, os cientistas adicioanram uma sonda fluorescente acoplada a uma fita simples de DNA. Quando a enzima Cas12a reconhece o DNA viral, ela inicia a clivagem das fitas simples, liberando as sondas fluorescentes. Essa sonda, quando liberada, emite luz fluorescente, a qual pode ser captada por um detector.
Esquema de funcionamento dos biossensores de detecção viral. A) Sistema DETECTR. Possuí três partes: a enzima Cas12a que reconhece o RNA viral; a fita guia de RNA que ira guiar a Cas12a a sequência de DNA viral de interesse; e sondas fluorescentes acopladas com DNA fita simples. Quando a enzima Cas12a reconhece o DNA viral, ela inicia a clivagem das fitas simples de DNA, liberando a sonda fluorescente e gerando fluorescência. B) Sistema SHERLOCKv2. Funciona de um modo similar ao DETECTR. O SHERLOCKv2 utiliza a enzima Cas13 para encontrar o DNA viral e clivar o DNA fita simples acoplado à sonda fluorescente. Além disso, há uma segunda enzima, Csm6, que também cliva as construções de fitas simples, amplificando o sinal de fluorescência e melhorando a cinética da reação. fonte: artigo Nature.
Sistema SHERLOCKv2
O sistema SHERLOCKv2 (specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking version 2) é um sistema DETECTR melhorado. Ele utilizada uma outra enzima a Cas13, que foi otimizada para reconhecer até 4 vírus de uma única vez. Esse sistema pode detectar sequencias de DNA em concentrações tão baixas quanto 2 cópias por mililitro.
- Como o sistema funciona?
Além de adicionar a sonda fluorescente ligada a fitas simples de DNA, como descrito anteriormente, o sistema SHERLOCKv2 também possui uma segunda proteína do tipo Cas: a Csm6. A enzima Csm6 é ativada por produtos da ação da Cas13 e, após ativação, também cliva as fitas simples de DNA, liberando mais sondas fluorescentes e aumentando o sinal e a cinética do sistema SHERLOCKv2.
Como seriam os biossensores na prática
Ambas as técnicas podem ser utilizadas para construção de uma simples ferramenta de diagnóstico: uma gota de amostra (sangue de paciente, por exemplo) pode ser aplicada numa tira de papel que contenha o sistema, e um resultado colorimétrico é exibido. Este formato, semelhante aos testes rápidos de detecçao de HIV e hepatite, não necessita de equipamentos, permitindo que possa ser utilizado por médicos e profissionais de saúde em regiões com baixa infraestrutura hospitalar.
Essa abordagem, por ser muito específica, pode ser utilizada para discernir entre espécies virais similares, que apresantam sintomas muito semelhantes e dificultam um diagnóstico clínico preciso.
Há também a perspectivas desses sistemas serem utilizados para detecção de tumores – com mutações cancerígenas específicas-, e para detecção de contaminantes biológicos na agricultura e na indústria.
