SDS-PAGE é uma sigla para Gel de Poliacrilamida (PAGE) com dodecil-sulfato de sódio (SDS), ou seja, um gel composto de um polímero de acrilamida adicionado de SDS. A corrida de eletroforese por SDS-PAGE é um método muito utilizado em laboratórios de Ciências da Saúde, e seu objetivo é a separação de proteínas por peso molecular (tamanho). Com isso, é possível realizar a caracterização qualitativa e semiquantitativa das proteínas presentes em uma amostra.
Um dos primeiros trabalhos que relatou o uso de SDS-PAGE foi o de Laemmli, em 1970, que aplicou a técnica para caracterizar as proteínas componentes da cabeça do bacteriófago T4. De lá pra cá, essa técnica se popularizou muito, e é possível que você se depare com ela se for trabalhar em um laboratório de biotecnologia Por isso, vamos aprender o que é eletroforese, como preparar o gel, qual a função dos seus componentes, suas aplicações e a maneira de interpretar seus dados.
Corrida de eletroforese
A eletroforese é muito utilizada para a separação de biomoléculas e baseia-se na aplicação de um campo elétrico que irá permitir a migração daquelas que estiverem carregadas eletricamente. No caso do SDS-PAGE, as proteínas são inseridas em poços na parte de cima do gel, e todas elas estão carregadas negativamente devido a sua ligação com o SDS. Dessa forma, elas migram em direção ao polo positivo, que fica na parte de baixo do gel. Também é importante utilizar uma amostra-padrão de proteína, ou seja uma amostra que possui uma mistura de vários pesos moleculares conhecidos para que se possa comparar a amostra que está sendo estudada e identificar qual o peso molecular das suas proteínas.
Composição química e suas funções na composição do gel e da corrida
O gel é formado a partir da polimerização (formação de uma matriz reticulada) de acrilamida e bisacrilamida (N,N’-metilenobisacrilamida), que possui poros pelos quais irão passar as proteínas. A concentração de poliacrilamida no gel determina a capacidade de separar proteínas com maior ou menor peso molecular, devido ao tamanho dos poros formados.
Quanto maior a concentração de acrilamida, menores serão os poros e as proteínas que conseguirão migrar através da coluna. Tendo isso em vista, as proteínas menores conseguirão migrar mais rapidamente e, por isso, vão formar bandas (“manchas”) mais embaixo no gel, enquanto as proteínas maiores ficarão retidas na parte superior da matriz polimérica.
Para que seja realizada a separação das proteínas por eletroforese, são preparados dois tipos de géis diferentes, o gel de empilhamento e o gel de resolução/corrida. O gel de empilhamento apresenta baixa porcentagem de acrilamida (5%) e a sua função é concentrar uma amostra com proteínas de diversos pesos moleculares, fazendo com que todas cheguem ao mesmo tempo no gel de corrida.
Já o gel de corrida ou resolução tem esse nome pois é nele que ocorre efetivamente a corrida de eletroforese e onde serão separadas as proteínas (resolução). Esse gel pode ser preparado com concentrações diferentes de acrilamida (de 5 a 18%), a depender da faixa de peso molecular das proteínas que se deseja separar, como descrito na tabela a seguir:
| Concentração de acrilamida no gel | Faixa de peso molecular das proteínas (resolução de separação) |
| 5% | 60 – 220 kDa |
| 7,5% | 30 – 120 kDa |
| 10% | 20 – 75 kDa |
| 12% | 17 – 65 kDa |
| 15% | 15 – 45 kDa |
| 17,5% | 12 – 30 kDa |
Fonte: Neobio.
Alguns reagentes químicos são adicionados à mistura de acrilamida e bis-acrilamida para auxiliar no início da polimerização e formação do gel, tais como o persulfato de amônio (APS), que serve como fonte de radicais livres, e o Temed, que é um estabilizador da reação.
O SDS é um surfactante (detergente) que tem a função de desnaturar as proteínas, quebrando as ligações das cadeias polipeptídicas. Além disso, ele possui carga negativa, o que confere essa mesma carga a todas as proteínas da amostra. Este último detalhe é importante para a corrida de eletroforese, pois elimina a interferência da diferença de carga entre as proteínas. Ao passo que todas elas adquirem carga negativa, todas irão migrar para o polo positivo da corrente, sendo possível separá-las exclusivamente por diferença de peso molecular.
Uma das ligações mais importantes para a manutenção da estrutura tridimensional das proteínas são as pontes dissulfeto, que são rompidas por dois agentes redutores, o ditiotreitol (DTT) e o betamercaptoetanol.
Após a confecção do gel e a adição das amostras de proteínas nos poços, o gel é ligado a uma fonte de eletroforese, que irá criar o campo elétrico necessário para separação das proteínas. A corrida eletroforética pode durar alguns minutos ou até horas, dependendo do sistema. E após sua conclusão, ainda é necessário realizar a coloração do gel.
Coloração
Quando a eleforese termina, as proteínas estão todas distribuídas no gel de acordo com seu peso molecular, mas não é possível visualizá-lass porque elas não têm cor. Dessa forma, é necessário que seja feita uma etapa de coloração do gel.
Um dos métodos de coloração do gel de SDS-PAGE utiliza o azul de Comassie, um corante que foi primeiramente empregado na indústria têxtil, mas que, devido a sua afinidade por proteínas, passou a ser aplicado nos laboratórios de Biotecnologia. Entretanto, uma limitação do azul de Comassie é que ele não cora tão bem géis com amostras que possuem pouca proteína. Nesse caso, é mais indicado o uso de corantes à base de prata, que apresentam maior afinidade a essas biomoléculas que o azul de Comassie.
Independentemente do tipo de corante, em geral são necessárias 3 etapas para se finalizar um gel:
- Fixação: uma solução é adicionada ao gel e vai fixar as proteínas nele para que não se dispersem;
- Coloração: etapa que vai adicionar cor às proteínas do gel;
- Revelação/Descoloração: etapa que irá revelar a cor das bandas de proteínas ou descorar as partes do gel que não possuem proteína.
Aplicação e Como interpretar o resultado do gel
As aplicações do gel de SDS-PAGE são muitas e cruciais em um laboratório que trabalha com proteínas. Por exemplo, com os resultados da técnica, é possível realizar a caracterização qualitativa e semiquantitativa de uma amostra de proteínas. É possível, ainda, determinar quais são os pesos moleculares das proteínas que compõem aquela amostra e também quais estão em maior abundância, já que as bandas que possuem mais proteínas vão ser corar mais fortemente e ficar mais visíveis no gel. Também é possível extrair as proteínas de uma banda específica do gel e determinar exatamente quais são as moléculas presentes nela por técnicas mais precisas como a espectrometria de massas.
Com o gel de SDS-PAGE também é possível determinar a pureza de uma amostra. Se, por exemplo, espera-se que uma amostra seja composta por um único tipo de proteína, o resultado da eletroforese deve apontar apenas uma banda no gel. Por outro lado,se houverem mais bandas, sabe-se que a amostra não está pura. Com essa técnica também é possível comparar as proteínas presentes em amostras diferentes e identificar quais as semelhanças e diferenças entre elas.
Muitas são as aplicações e as variações encontradas nos métodos de separação de proteínas por eletroforese. As técnicas descritas aqui são apenas algumas delas. Continue lendo os textos do Profissão Biotec e pesquisando sobre se você se interessa pelo assunto.
Cite este artigo:
MEDRADES, J. P. Desvendando os Segredos da Eletroforese: Da Preparação do Gel à Interpretação dos Resultados na SDS-PAGE. Revista Blog do Profissão Biotec, v. 11, 2024. Disponível em: <https://profissaobiotec.com.br/desvendando-os-segredos-da-eletroforese-da-preparacao-do-gel-a-interpretacao-dos-resultados-na-sds-page>. Acesso em: dd/mm/aaaa.
Referências:
NEOBIO. A ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA. Disponível em: < https://neobio.com.br/blog/a-eletroforese-em-gel-de-poliacrilamida>. Acesso em: 23 jan. 2024.
MERCK. Introdução à SDS-PAGE – Separação de proteínas com base no tamanho. Disponível em: <https://www.sigmaaldrich.com/BR/pt/technical-documents/protocol/protein-biology/gel-electrophoresis/sds-page>. Acesso em: 23 jan. 2024.
MBL life science. The principle and method of polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Disponível em: <https://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/sds-page.html>. Acesso em: 23 jan. 2024.
Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v. 227, n. 5259, pp. 680-685, 1970. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/5432063/>. Acesso em: 23 jan. 2024.
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