O que é o RT-LAMP (Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification), a nova técnica de diagnóstico para COVID-19 que promete dar o resultado em até 24h? Bem, essa é uma tecnologia relativamente nova, baseada em uma técnica de biologia molecular chamada de Amplificação isotérmica mediada por loop (em tradução livre). Ela foi criada em 2012 e desde então é usada por cientistas para estudos de vírus, entre eles os vírus da zika, dengue e chikungunya.
. E no Brasil, a técnica de RT-LAMP para diagnóstico de COVID-19 começou a ser vendida em farmácias em dezembro de 2020, no valor de 90 a 170 reais. O laboratório Mendelics em parceria com o Hospital Albert Einstein desenvolveu um teste usando RT-LAMP que já está sendo comercializado em farmácias brasileiras. A Universidade de São Paulo (USP) e a Universidade Federal de Goiás (UFG) já estão desenvolvendo um teste de diagnóstico baseado nessa tecnologia. O teste é similar ao RT-PCR, pois também verifica a presença de RNA viral, porém promete ser mais rápido e pode ser realizado com a saliva.
Ainda existem outros tipo de testes sorológicos e testes rápidos para diagnóstico de COVID-19 que podem ser encontrados em alguns laboratórios e farmácias.
Como funciona o RT-LAMP?
Assim como o RT-PCR, o RT-LAMP usa a enzima transcriptase reversa (RT) (por isso ambas as técnicas têm RT no nome), que é uma enzima capaz de sintetizar DNA utilizando RNA como molde (material genético do vírus), visto que a técnica usa a enzima transcriptase reversa. As semelhanças param por aí, pois enquanto o RT-PCR, padrão ouro para diagnóstico de COVID-19, utiliza um swab nasal para coletar a amostra da mucosa do paciente, a qual é submetida à extração de RNA e à análise de RT-PCR; o RT-LAMP utiliza amostras de saliva que podem ser coletadas pelo próprio paciente. A etapa de amplificação do RT-LAMP ocorre em uma únicafaixa de temperatura, 60 a 65ºC, diferente do RT-PCR cuja reação ocorre em três temperaturas diferentes (etapas de desnaturação, anelamento e amplificação) .
De forma geral, a técnica de RT-LAMP usa a saliva como método de coleta, visto que não é invasiva e pode ser feita pela própria pessoa. No laboratório, RT-LAMP é mais simples e não necessita de equipamentos tão sofisticados e caros como a técnica de PCR, o que também é uma vantagem.
Em detalhes, a técnica RT-LAMP consiste em converter o RNA em cDNA (DNA complementar) por meio da enzima transcriptase reversa (RT). De quatro a seis primers podem ser usados para a amplificação, onde dois desses são internos (FIB e BIP) e serão a base para a enzima DNA polimerase Bst (Bacillus stearothermophilus – resistente ao calor) começar a síntese de fita de cDNA. Enquanto os outros dois são primers externos chamados de F3 e B3, que reconhecem a fita molde e fazem a extensão da fita de cDNA.
A amplificação tem início quando um primer interno (F2) se liga ao seu receptor (F2c) (presente na amostra de RNA alvo) e começa a criar uma fita complementar no sentido 5’ – 3’. Em seguida um primer externo (F3) se liga ao seu receptor na fita molde (F3c) e cliva primeiro produto da fita complementar (F1c), que irá formar uma alça (loop), isto porque o primer FIP irá ligar a ele mesmo, ou seja, a porção F1 da fita complementar, se liga a porção F1c, da fita complementar, formando uma alça, como demonstrado na figura a seguir. Após um lado ser feito, o mesmo acontece para o lado de BIP, onde o primer interno (B2) se liga ao seu receptor (B2c) e cria uma fita complementar no sentido 3’ – 5’. Então o primer externo de BIP o B3 se liga ao produto da fita molde B3c e começa a clivar o produto da fita complementar que estava sendo criado, dessa forma os primers B1 se liga com o B1c e forma-se uma alça, e assim segue até o fim da amplificação.
É importante salientar que a alça (o “loop”) criada pode ter diferentes formas, normalmente de halteres, mas pode ter outras formas abstratas e é isso o que dá especificidade ao teste.
A interpretação do RT-LAMP também pode ser feita de forma colorimétrica. A leitura do pH ocorre com o corante vermelho fenol. Quando o pH está entre 8,2 – 8,6, a amostra fica no tom de rosa, o que quer dizer que o resultado é negativo, e quando o pH se torna mais ácido, a amostra adquire uma coloração amarela que quer dizer que o teste teve resultado positivo. O que muda o valor do pH é a atividade da DNA polimerase, isto é, enquanto a DNA polimerase está em atividade ela reduz o pH. Isso modifica a cor do vermelho fenol de rosa para amarelo, o que torna o teste positivo, indicando a presença do vírus na amostra.
Quais as vantagens da técnica de RT-LAMP?
- Pode ser feita com amostra de saliva, de fácil coleta;
- Não necessita de purificação das amostras, devido a maior resistência da enzima RNA polimerase que é usada na técnica.
- Utiliza uma temperatura constante (condições isotérmicas) , permitindo o uso de equipamentos simples de PCR (termocicladores) ou o uso de banhos-térmicos;
- O produto da reação forma uma mistura de DNA com tamanhos e estruturas específicas,o que torna a técnica mais seletiva e aumenta a sensibilidade;
- A técnica é extremamente específica para a sequência alvo, já que possui até seis sequências de primers específicos;
- Não utiliza sondas fluorescentes para análise, o que torna o ensaio mais barato e sem necessidade de importação de reagentes;
- Execução fácil;
- Pode ser utilizada junto de corantes, o que torna a técnica cabível de ser observada em tempo real sem a necessidade de um equipamento de leitura;
- Mais rápido e aplicável em larga escala;
Porém, há desvantagens também, como:
- Possui algumas restrições para o desenho dos primers;
- Abordagens multiplex são menos desenvolvidas, isto é, a técnica não consegue ler vários alvos ao mesmo tempo;
- Existe o risco de contaminação de outras pessoas durante manuseio da amostra, especialmente quando se trata de amostra de saliva, uma vez que o vírus ainda pode estar ativo na amostra. Este risco de contaminação também está presente em coletas e análises de RT-PCR. Para mais informações sobre como os cientistas não se contaminam com as amostras eu recomendo a seguinte leitura: Como os cientistas estudam o novo coronavírus sem se contaminar?
O RT-LAMP veio como uma nova abordagem para o diagnóstico molecular da COVID-19. Promete ser uma técnica mais rápida e ter a mesma eficácia que o RT-PCR, indicando se a pessoa está ou não infectada pelo vírus. A testagem do vírus ajuda nos dados de pesquisa para mostrar os números de casos por dias e por períodos por isso a testagem é fundamental e deveria ser feita no máximo de pessoas possível, infelizmente essa não é a realidade que enfrentamos no Brasil, mas para aqueles que podem e querem saber o resultado de forma rápida, hoje temos essa opção sendo disponibilizada em farmácias.
Cite este artigo:
GUIDOTTI, I. RT-LAMP: como funciona o novo teste de diagnóstico para COVID-19. Revista Blog do Profissão Biotec, v.8, junho/2021. Disponível em: <https://profissaobiotec.com.br/rt-lamp-como-funciona-o-novo-teste-de-diagnostico-para-covid-19/ > Acesso em: dd/mm/aaaa
