Com a ocorrência da pandemia de COVID-19, fomos bombardeados de informações com as quais não tínhamos muito contato, em alguns casos, de difícil compreensão. No entanto, esse grande volume de conhecimento ajudou a termos mais contato com algumas técnicas frequentemente utilizadas em ambiente laboratorial para diagnóstico e/ou pesquisa. Uma dessas técnicas foi o ensaio de ELISA, sigla do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ensaio de imunoabsorção enzimática).
O teste de ELISA
O teste de ELISA foi desenvolvido em 1971 por Eva Engvall e Peter Perlman em lugares distintos, pois os princípios da técnica já existiam. Ele foi criado como uma alternativa ao radioimunoensaio (RIA), pois esse é um teste potencialmente perigoso à saúde dos pesquisadores. No entanto, até o ELISA ser desenvolvido, não havia outro tipo de ensaio com propriedades similares que pudessem substituir o RIA. O RIA é um ensaio que se baseia na interação entre antígeno-anticorpo para quantificar a presença de antígenos no soro (por exemplo hormônios e insulina), com alta fidelidade, utilizando radioisótopos (isótopos emissores de radiação).
O ELISA é um método de análise colorimétrica quantitativa que tem como estratégia base o reconhecimento e a interação antígeno-anticorpo. A quantificação se dá pela geração de cor que varia de acordo com a intensidade da reação. O teste de ELISA é muito utilizado e conhecido por possuir níveis altos de especificidade para antígenos ou anticorpos. No entanto, quando se fala sobre “o método de ELISA” a referência é um teste imunoenzimático baseado na interação entre antígeno e anticorpo e não um único tipo de teste, pois existem diferentes tipos de ELISAs.
Etapas do teste
Os diversos tipos de testes de ELISA possuem algumas etapas em comum, mesmo sendo teste diferentes, são elas:
(1) a sensibilização na qual é adicionado o antígeno ou anticorpo para que esse seja aderido à placa;
(2) a incubação com a amostra teste;
(3) a incubação com antígeno ou anticorpo complexado à enzima;
(4) a incubação com solução reveladora (o substrato que vai interagir com a enzima);
(5) a adição da solução de parada; e,
(6) a leitura em espectrofotômetro.
Entre as etapas de 1 a 4, ao final de cada uma delas, é realizada a lavagem da placa para que sejam eliminadas moléculas que não se ligaram.
Nos testes de ELISA, uma das etapas mais importantes é a lavagem. Essa é realizada entre as incubações para que sejam removidos os excessos de antígenos ou anticorpos não ligados. Essa etapa é importante e deve-se dar muita atenção, pois caso seja ineficiente, o resultado do teste poderá ser comprometido. A lavagem é realizada ao final de cada incubação.
Para obter-se a quantificação no teste a presença de uma enzima e um substrato são necessárias, pois a interação entre eles será a responsável por gerar a coloração. Quanto maior a presença da enzima, mais intensa será a coloração gerada. Para parar essa reação é necessário adicionar uma solução de parada e seguir imediatamente para avaliação em aparelho específico para avaliação da intensidade da coloração (espectrofotômetro).
Tipos de ELISA
O princípio de técnica de ELISA (interação antígeno-anticorpo) já era conhecido antes da criação do método. Existem 4 tipos principais de ELISA, sendo esses:
- O ELISA direto (1971) foi o primeiro a ser desenvolvido. Esse tipo de teste é capaz de identificar a presença de um antígeno ou anticorpo específico de forma direta. Sendo assim, os poços da placa são revestidos com o antígeno ou o anticorpo que se quer testar e o seu par complementar complexado à enzima é adicionado. Para que ocorra a formação de cor é necessária a adição de um substrato que vai interagir com enzima complexada e irá gerar a cor. A coloração gerada é diretamente relacionada à proporção de interação antígeno-anticorpo, sendo assim, quanto maior for a interação, mais escura será a cor resultante.
- No ELISA de competição (1976) ocorre uma competição pela ligação ao antígeno (ou anticorpo) ligado à placa. Essa competição ocorre entre o anticorpo (ou antígeno) da amostra teste que não é marcado com a enzima e, portanto, não resulta em coloração quando se liga e o anticorpo (ou antígeno) marcado com enzima (amostra controle) que depois da adição do substrato irá resultar em coloração. As duas amostras são incubadas simultaneamente, de forma que, a amostra mais concentrada se liga mais ao antígeno (ou anticorpo) fixado à placa. A amostra que estiver em maior concentração realizará mais ligações e será a “vencedora da competição”. Como a amostra de interesse não gera coloração na ligação, quanto maior sua concentração, menor a intensidade da cor no ensaio. Sendo assim, esse é o único tipo de ELISA que quanto mais intensa a coloração final menor será a concentração da amostra testada.
- O ELISA sanduíche (1977) leva esse nome por ser “similar a um sanduíche”. Esse tipo de ELISA é capaz de quantificar somente a presença de antígenos, pois o antígeno fica preso entre o anticorpo que reveste os poços da placa e o anticorpo marcado com enzima. Imagine um sanduíche de queijo no qual há duas fatias de pão (uma de cada lado), que representam os anticorpos, e o queijo se encontra abrigado no meio delas, representando o antígeno testado. Esse ELISA é capaz de quantificar a presença de antígeno em uma amostra gerando coloração mais intensa quanto maior o número de ligações ocorridas.
- O ELISA indireto (1978) é similar ao ELISA direto, no entanto, a principal diferença se dá porque a quantificação é indireta. Isso porque é necessário adicionar um segundo anticorpo (o anticorpo secundário) o qual é complexado com a enzima e esse será o responsável por gerar cor. Esse tipo de ELISA é capaz de identificar a presença de antígenos em uma amostra de maneira proporcional à quantidade de complexos antígeno-anticorpos formados.
O ELISA pode ser utilizado para testar diferentes tipos de amostras e para escolher o melhor tipo a se usar deve-se levar em consideração fatores como qual molécula se quer avaliar e o que pode ser analisado na amostra. Um exemplo de uso do teste de ELISA é a pesquisa sorológica de anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV). O ELISA também é um dos métodos utilizados para detectar a infecção por SARS-CoV-2.
Como se pode notar, os usos do ELISA são diversos e bastante presentes na rotina clínica. Esse método, desenvolvido em 1971, é até hoje muito importante para o diagnóstico. Sendo assim, quando falamos de ELISA não estamos falando de um teste específico, mas uma forma específica de se realizar um teste.
Cite este artigo:
LOPES, N. R. Quando falamos de ELISA: é um teste específico? Revista Blog do Profissão Biotec, v.9, 2022. Disponível em: <https://profissaobiotec.com.br/quando-falamos-de-elisa-e-um-teste-especifico/>. Acesso em: dd/mm/aaaa.
Referências
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. 9. ed. [s.l.] Elsevier Editora Ltda., 2019.
AYDIN, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, v. 72, p. 4–15, out. 2015. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.peptides.2015.04.012.
OLSEN, C. The history of ELISA from creation to COVID-19 research. Molecular devices. 14 dez. 2020. Disponível em: <https://www.moleculardevices.com/lab-notes/microplate-readers/the-history-of-elisa>. Acesso em: Maio 2022.
SWANSON, W.; STAASTAD, F. V.; GRIFFITH, T. S.. ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive. JoVE Science Education, Cambridge, MA, (2022). Disponível em: <https://www.jove.com/v/10496/elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive>. Acesso em: Jun 2022.
Fonte da imagem destacada: Canva.
