Para garantir a alta produtividade de um bioprocesso é preciso conhecer as necessidades do microrganismo/célula utilizado, entender as limitações e características de cada fase do bioprocesso e utilizar da melhor forma os recursos oferecidos por equipamentos como a incubadora orbital tipo shaker.
A seguir abordaremos os principais aspectos que influenciam a produtividade do seu experimento como a escolha das condições de cultivo, densidade da biomassa, e controle de evaporação.
1 – Escolha do microrganismo ou célula utilizada no bioprocesso
Já vimos em textos anteriores como escolher a melhor incubadora de agitação orbital para o seu bioprocesso e quais as boas práticas de utilização desse equipamento. Mas para ampliar a produtividade de um bioprocesso também é fundamental conhecer o microrganismo ou célula utilizado no experimento.
Primeiramente, é importante conhecer a biomolécula de interesse que será obtida no seu bioprocesso. Dessa forma, é possível escolher o melhor microrganismo/célula para ser utilizado no seu experimento.
Tanto organismos eucariotos (como leveduras e células de mamíferos) quanto procariotos (bactérias) podem ser utilizados em bioprocessos, mas as características e necessidades de cada um devem ser observadas com atenção. Aqui apresentamos algumas características gerais, mas cada microrganismo específico apresenta uma demanda de cultivo individual que deve ser determinada.
As bactérias podem crescer em diferentes condições de cultivo, incluindo altas temperaturas (normalmente entre 20º e 60º C), podendo crescer em altas concentrações de sal (bactérias halófilas) ou diferentes tempos de cultivo (entre 8 e 60 horas ou mais). Por isso é importante observar o tipo de bactéria utilizada no bioprocesso (anaeróbica x aeróbica, heterotrófica x autotrófica, entre outros) para definir esses parâmetros.
As leveduras são fungos unicelulares e possuem condições de cultivo semelhantes a das bactérias, porém possuem algumas preferências como o pH ligeiramente mais ácido, a temperatura mais amena (faixas normalmente em torno de 25-30ºC) e podem exigir um sistema de resfriamento eficiente (visto que o metabolismo das leveduras gera muito calor, assim como as bactérias).
Os fungos multicelulares tendem a crescer aderidos à parede do recipiente, resultando em uma cultura mais viscosa, dificultando a definição das condições ideais de cultivo. Em geral, são cultivados entre 20-25ºC e possuem um tempo de cultivo acima de 72 horas.
Já o cultivo de células de mamíferos e vegetais necessita de cuidados ainda mais específicos. Enquanto as células de mamíferos são mantidas geralmente a 37ºC normalmente com atmosfera de 5% de gás carbônico com tempo de cultivo de 96 horas (ou mais) e são muito sensíveis à tensão de cisalhamento, as células vegetais são normalmente cultivadas entre 20 e 28ºC.
Por isso, antes de iniciar seu bioprocesso busque referências, protocolos e informações sobre o microrganismo ou célula que você utilizará. Isso evitará repetições desnecessárias, perda de tempo e recursos, além de aumentar a eficiência do seu experimento.
2 – Densidade da biomassa
A quantidade total de biomassa e sua taxa de crescimento são parâmetros fundamentais para definir a produtividade e o rendimento de um bioprocesso. Dessa forma, utilizar uma tecnologia que permita uma fácil medição da densidade da biomassa pode otimizar o seu experimento. As tecnologias mais usadas são:
a) Densidade óptica por Espectrofotometria (também chamado de DO600): técnica que mede a biomassa por meio da densidade óptica através de um feixe de luz com comprimento de luz a 600 nm. Uma amostra da biomassa é coletada, adicionada em uma cubeta e analisada no espectrofotômetro. O equipamento mede a intensidade do feixe de luz antes e depois da amostra, permitindo o cálculo da densidade óptica da biomassa. É importante destacar que as características do próprio meio de cultivo (opacidade, presença de compostos que absorvem luz etc) podem interferir nos resultados da medição.
b) Medição de luz retroespalhada: técnica em que a luz é emitida por uma fonte e interage com as células da biomassa, dispersando em diferentes direções. A intensidade de luz dispersada é convertida em corrente elétrica. Quanto maior a densidade celular da biomassa, maior é a dispersão da luz. Trata-se de um sistema automatizado online que permite o monitoramento dos dados em tempo real, com reduzido risco de falha humana.
c) Massa seca: Existe ainda o método de determinação de massa seca (dry cell weight ou DCW) que consiste na coleta de uma amostra da suspensão do meio de cultura, que é centrifugada, seca (em estufa) e posteriormente pesada. Trata-se de uma técnica simples mas que apresenta desvantagens (como a necessidade de um volume maior de amostra e a maior chance de perda de material) e por isso não é comumente usada.
Todas as três técnicas são eficientes para medição de biomassa em bioprocessos realizados em incubadora de agitação orbital ou biorreator. A escolha da melhor técnica para o seu experimento irá depender principalmente dos recursos financeiros e da mão de obra capacitada disponível em seu laboratório.
3 – Controle de evaporação do meio de cultivo
Dentre as condições consideradas ideais para um bioprocesso, uma das que mais influencia a produtividade é o volume do meio, que pode ser afetado pela evaporação. Isso porque durante o bioprocesso a água evapora, concentrando o meio de cultura. Consequentemente podem ocorrer alterações de osmolaridade, concentração de sais e viscosidade, prejudicando o crescimento e a produtividade da sua biomassa.
Os sistemas de umidificação, presentes na incubadora de agitação orbital, previnem a evaporação, aumentando os níveis de umidade. Esses sistemas são ainda mais importantes se o seu experimento requer altas temperaturas ou longos períodos de cultivo, fatores que favorecem a evaporação.
O reservatório de água aberto é o mais simples sistema de umidificação. Ele mantém a umidade do ambiente e pode ser uma solução econômica a curto prazo. Este tipo de recurso consiste em posicionar um recipiente com água dentro da incubadora orbital. Preferencialmente, o vasilhame deve ter ampla superfície de contato entre a água e a atmosfera interna do equipamento, a fim de favorecer a evaporação da água do recipiente e minimizar a evaporação da água do meio de cultura. Este tipo de recurso não permite um controle efetivo da evaporação de cultivo, portanto, apesar de reduzida, haverá perdas por evaporação. Além do mais, a água condensada e a água que permanece no sistema podem aumentar os riscos de contaminação visto que o ambiente interno da incubadora possui condições favoráveis de crescimento para a ampla maioria dos microrganismos.
Existem ainda as caixas com filtro de ar, que podem atuar como barreira para a evaporação sem necessidade de umidificação; a umidificação direta a vapor, que faz o controle unilateral da umidade, com menor risco de contaminação; e o controle bilateral da umidade que permite o aumento ou redução da umidade na incubadora orbital, possibilitando que o pesquisador faça o ajuste desejado. É considerado o “padrão-ouro” dos sistemas de controle de evaporação.
4 – Escolha do diâmetro do orbital
Outro parâmetro importante durante a escolha da incubadora orbital é o diâmetro de orbitação no qual a bandeja é agitada. O diâmetro do movimento circular da bandeja durante a agitação orbital, por vezes também é chamado de orbital, diâmetro de agitação ou throw. Esse parâmetro afeta diretamente a força centrífuga que o equipamento aplica aos frascos de cultivo, que por sua vez, implica nos parâmetro de cultivo como, por exemplo:
- Nível adequado de homogeneização de meio reacional: há uma relação entre a dimensão do frasco e o diâmetro utilizado para obter uma agitação otimizada. De forma geral, frascos de até 2 litros devem ser agitados em orbitais de 25 milímetros e frascos maiores que 2 litros devem ser agitados com orbitais maiores que 50 milímetros. As velocidades nessas condições, normalmente são entre 100 e 300 rotações por minuto;
- Tensão de cisalhamento para células eucariontes: o cisalhamento provocado pela agitação pode ser um problema principalmente para as células de mamíferos e insetos. Como solução é possível manter a força centrífuga diminuindo a velocidade de agitação e aumentando o diâmetro do orbital. Nesse caso, é comum trabalharmos sempre com diâmetro de 50 milímetros e velocidades entre 40 e 100 rotações por minutos;
- Área da interface gás-líquido dentro do frasco: quanto maior a força aplicada, maior é a área de contato entre o meio de cultivo líquido e a atmosfera presente dentro frasco devido à concavidade formada na interface;
- Cultivo em placas deep well (poços profundos): para que o cultivo nesse tipo de placa seja bem sucedido, é necessário trabalhar com diâmetros muito pequenos (em torno de 3 milímetros) e velocidades de 1000 rotações por minuto. Esse tipo de sistema pode ser utilizado tanto para cultivo microbiano quanto para células, e é ideal para triagens genéticas, nutricionais, etc.
É importante ter em mente que para caracterizar o sistema de agitação do equipamento é necessário fornecer tanto a velocidade de agitação quanto o diâmetro do orbital. Alternativamente pode ser fornecido apenas a força centrífuga, que depende dos dois parâmetros citados. Para a caracterização completa do cultivo ainda é necessário adicionar as informações de geometria de frasco, carga e dimensão.
Por fim, um desafio comum é a reprodução de condições de agitação quando o trabalho ocorre em equipamentos diferentes.Como regra geral, podemos apenas multiplicar por 0,7071 a agitação do orbital de 25 milímetros para obter a nova velocidade para um sistema que trabalha com orbital de 50 mm e mesmo assim manter a mesma força centrífuga. Obviamente, há formas mais apuradas de fazer essa conversão, mas essa é a mais fácil.
Automatização do bioprocesso em incubadora de agitação orbital pode ser uma boa opção
Atualmente, os softwares de bioprocessamento (recursos presentes em equipamentos como alguns tipos de incubadora orbital, e precisam estar acoplados a sensores e/ou outro equipamento) permitem o acompanhamento do bioprocesso, mesmo que remotamente; o planejamento de experimentos; a coleta, análise e visualização dos dados de diferentes fontes; estratégias de cultivo baseadas em fase-transição e o compartilhamento de dados com outros usuários. Esses benefícios contribuem para a reprodutibilidade do bioprocesso e dos resultados.
A digitalização do bioprocesso impacta diretamente o custo, o tempo e a qualidade dos seus resultados. Isso porque o planejamento e documentação manual dos seus experimentos podem gerar resultados imprecisos, necessidade de repetição das análises e atraso dos experimentos.
A utilização do software requer maior investimento financeiro e capacitação dos profissionais que manipulam a incubadora orbital, mas certamente otimizará o trabalho, aumentará a produtividade e fornecerá resultados mais confiáveis.
Alcançar a alta produtividade é um dos principais objetivos de um bioprocesso. Por isso, é preciso planejar com antecedência o experimento (escolhendo o microrganismo/célula de interesse, estabelecendo as condições de cultivo) e ter atenção ao longo do experimento (monitorando a biomassa, a evaporação) e utilizar ferramentas que melhorem o tempo e a qualidade dos resultados.
No próximo texto da série sobre bioprocessos em incubadora de agitação orbital, apresentaremos as ações que podem aprimorar seu bioprocesso, e abordaremos todas as vantagens e possibilidades da transferência do seu bioprocesso da incubadora orbital para um biorreator.
Este é um texto patrocinado pela INFORS HT, especialista em biorreatores, agitadores-incubadoras e software de controle de bioprocessos.
Cite este artigo:
LOPES, B. P. Fatores que influenciam um bioprocesso em Incubadora de agitação orbital. Revista Blog do Profissão Biotec, v. 8, 2021. Disponível em: <https://profissaobiotec.com.br/fatores-influenciam-bioprocesso-em-incubadora-agitacao-orbital/>. Acesso em: dd/mm/aaaa.
