PCR: A tecnologia por trás dos testes de DNA

PCR, abreviação de Polymerase Chain Reaction (em português, Reação da Polimerase em Cadeia), é uma técnica da biologia molecular baseada na capacidade da enzima DNA polimerase sintetizar uma nova fita de DNA complementar a uma fita molde. Com essa técnica, uma pequena quantidade de fragmento de DNA pode ser clonada em milhões de cópias, facilitando a sua detecção, que pode ocorrer através da utilização de corantes e outras técnicas de visualização.

O processo de PCR tornou possível realizar o sequenciamento de DNA e identificar a ordem dos nucleotídeos de genes individuais.

Originalmente desenvolvida, em 1983, pelo bioquímico americano Kary Mullis, tendo-lhe rendido o prêmio Nobel de Química dez anos depois, a PCR é reconhecida como um dos avanços científicos mais importantes da biotecnologia moderna. Com esta técnica, cientistas são capazes de:

• Identificar potenciais suspeitos, os quais o DNA podem combinar com evidências deixadas em locais de crimes;
• Exonerar pessoas acusadas erroneamente de crimes;
• Identificar vítimas de catástrofes;
• Estabelecer paternidade ou outras relações parentais;
• Detectar bactérias e outros organismos capazes de poluir o ar, água, solo e alimentos;
• Combinar doadores de órgãos com receptores em programas de transplantes;
• Determinar o pedigree de gado;
• Autenticar bebidas como o vinho.

Nas ciências forenses, particularmente, a PCR é especialmente útil porque amplifica a menor quantidade de DNA de evidência.

A técnica de PCR aparece também em filmes e programas de televisão (já assistiram o teste de DNA do Programa do Ratinho?), servindo também de inspiração para os livros e filmes de Jurassic Park, nos quais os dinossauros voltam à vida porque seus DNAs, preservados em pedras de âmbar, puderam ser copiados por PCR.

Mas então, como funciona a PCR?

Os princípios por trás da PCR são os mesmos independentemente da amostra de DNA. São necessários cinco “ingredientes principais “, sendo eles:

• A amostra do DNA a ser copiado;
• Primers (iniciadores) – pequenos trechos de DNA que iniciam a reação de PCR, desenhados  para se ligar à região de DNA desejada;
• Bases nucleotídicas (também conhecido como dNTPs). As bases de DNA (A, C, G e T) são os blocos de construção do DNA necessários para construir a nova fita;
• Enzima Taq polimerase para adicionar as novas bases de DNA;
• Solução tampão para garantir as condições adequadas para a reação.

A reação de PCR envolve um processo de aquecimento e resfriamento conhecido como ciclo térmico, que atualmente é realizado por máquinas (termocicladores). Existem três principais passos:

Processo de PCR (apenas um ciclo).

1. Desnaturação – a fita dupla de DNA molde é aquecida e separada em duas fitas simples. A temperatura pode variar entre 94 – 98°C por aproximadamente 20-30 segundos;
2. Anelamento – a temperatura da reação é reduzida entre 50 e 65°C por  20 – 40 segundos para que ocorra o anelamento dos primers à fita simples de DNA molde. Durante esse passo, a temperatura é extremamente importante, pois se estiver muito elevada, o primer não se anela. Se estiver muito baixa, o primer pode se ligar imperfeitamente.
3. Extensão – a temperatura é aumentada e a nova cadeia de DNA é feita pela enzima Taq polimerase. A temperatura durante esse passo varia dependendo da polimerase utilizada.

Esses três estágios são repetidos por 20 – 40 vezes, dobrando o número de cópias de DNA a cada vez (amplificação exponencial). Uma reação de PCR completa pode ser realizada em poucas horas ou até mesmo em menos de uma hora, a depender do protocolo e do termociclador escolhidos.

Ilustração mostrando como ocorre a amplificação exponencial de DNA.

Existem diversos fatores distintos que podem ser manipulados para que ocorra o sucesso da PCR e melhoramento de seus resultados como:

• Condições limpas de laboratório para evitar contaminação;

• Pureza e integridade dos componentes químicos como o DNA molde e os primers desenhados;

• Atividade da polimerase;

• Escolha do termociclador;

• Configurações de ciclagem.

Para avaliar a presença do produto de PCR, o método mais utilizado é o gel de agarose, o qual separa os fragmentos de DNA baseados em tamanho e carga. O fragmento é então visualizado utilizado corantes ou radioisótopos.

Imagem de gel de agarose. Esse método separa os fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho.

Os avanços da PCR

Com o tempo, os cientistas foram aprimorando e desenvolvendo novas técnicas a partir da PCR convencional, como a RT-PCR e a PCR em tempo real.

A RT-PCR (ou PCR com Transcriptase Reversa), por exemplo, é uma técnica que utiliza a enzima transcriptase reversa, uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA, contribuindo com a identificação, estudos e melhor entendimento de vírus de RNA, como o HIV ou vírus da Dengue.

A PCR quantitativa em tempo real (Real-time PCR ou qPCR) é uma reação que combina a metodologia de PCR convencional com um mecanismo de detecção e quantificação por fluorescência. Dessa forma, é possível que os processos de amplificação, detecção e quantificação de DNA sejam feitos em uma única etapa. Isso torna a obtenção de resultados mais rápida e mais precisa ao diminuir o risco de contaminação da amostra.

Essas técnicas são de extrema importância para a Ciência atualmente e agora que você já as conhece, que tal compartilhar esse texto com seus amigos para que eles saibam também?

Referências

History of PCR. Roche molecular diagnostics. Disponível em: http://profissaobiotec.com.br/o-que-nos-faz-diferente-dna-fingerprinting/. Acesso em: 30/07/2017.

RT-PCR. Wikipédia. Disponível em: https://pt.wikipedia.org/wiki/RT-PCR. Acesso em: 30/07/2017.

What is Real-time PCR?. Bio-Rad. Disponível em: http://www.bio-rad.com/pt-br/applications-technologies/what-real-time-pcr-qpcr. Acesso em 30/07/2017.

Molecular Photocopies: Replicating DNA with Polymerase Chain Reaction. YOUTUBE. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=MkrcOoIDQmY. Acesso em: 30/07/2017.

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